光合细菌菌种分离与保藏

随着健康养殖渔业的发展，光合细菌越来越受到养殖者的青睐。光合细菌广泛分布于生物圈的各个角落，在净化水质、防治疾病和促生长方面效果明显，可作为鱼、虾、贝的饵料、饵料添加剂及浮游动物饵料。光合细菌的培养首先要有菌种，菌种是从它生活环境中的微生物群中分离出来的。笔者现以水产养殖和水质净化中常用的红螺菌种为例，简单介绍其分离和保藏技术，以供生产者参考。

菌种的分离

采样 

红螺菌种的种类在自然界中有有机污染的地方广泛存在。样品可以从河底、湖底、海底以及水田、池塘、沟渠等有污水进入的地方，以及食品工业污水排放处的橙黄色、粉红色泥土中获得。可以用杯子采集少量泥土，连水放入广口瓶或用采水器、采泥器取样。

为了获得密度较高的样品，也可以采取淡水池塘、池沼及海边的污泥，置入广口瓶中盖紧，分别加入几片海带或其它一些海藻，装满淡水或海水，置入日光下培养。大约一个月以后，瓶底就可以见到光合细菌的沉淀物。经过这样的简单培养后，可以直接对此菌作分离后进行纯培养。

富集 

富集培养时，将采集的样品装入玻璃圆筒或大型试管或具塞磨口玻璃瓶，再倒入配制好的培养液，充分搅拌。为造成厌气环境，在玻璃瓶或试管中加入液体石蜡以隔绝空气；磨口瓶只需将培养液加满加塞，以排除其中空气，瓶外再用塑料薄膜裹住扎牢，以减少水分蒸发。 培养温度为5℃～35℃。光照可以利用阳光，夜晚时则利用人工光源，光照强度的适宜范围为5000Lux～10000Lux。在这样的培养条件下，大约经过2周～8周的培养，在玻璃瓶壁上会出现光合细菌的菌落，或者整个培养液长成红色。如果是培养海水的光合细菌，因其生长缓慢，需要更长的富集培养时间。 

富集操作可以重复进行，方法是将初步富集的光合细菌的菌液或泥土移入磨口玻璃瓶中继续培养，反复多次，光合细菌占绝对优势时可确认富集成功。

为了避免在培养液中藻类和绿杆菌科的细菌的发展，可采用滤光片，使波长800纳米或更长波长的光透过，这样可以更有效地达到富集紫色非硫细菌的目的。另外，采用含有氯化物的培养基效果比采用硫酸盐培养基好，可以阻碍紫色硫细菌生长。

分离 

一旦富集培养成功，就可以紧接着进行分离培养。以紫色非硫细菌为例，其生长速度较快，大约在一周左右移植比较合适。若是海水生长的紫色非硫细菌则生长缓慢，约需3周。移植时先配制固体培养基，灭菌后浇成平板。将菌液做适当稀释后，用划线法或涂布法进行接种，然后置入厌气缸等容器中在厌气、光照条件下培养。在温度25℃～35℃，光照2000Lux～3000Lux的条件下培养2天～3天至7天左右，就能长出光合细菌菌落。仔细挑取单菌落，继续分离培养，反复多次，便能得到紫色非硫光合细菌的纯培养物。

在富集培养和分离培养时，不同的种类可以根据其不同的生态要求选择不同的培养条件。如荚膜红假单胞菌的纯分离，可在分离紫色非硫细菌所用的培养基中加入0.15%的丙酸钠，在光照条件下进行厌气培养，反复数次，以达到富集的目的。此外，把碳源基质改成葡萄糖，以0.1%～0.3%的量加入培养基中，经过反复几次培养，培养物中的荚膜红假单胞菌一般会占绝对优势。但其中厌气的异养细菌的生长可能也受到促进，所以有必要再一次以丙酸钠作为基质，进行分离培养。红螺菌属的种类可利用红螺菌属细菌具有快速运动能力的特点来分离，最后通过鉴定加以确证。

菌种保藏

紫色非硫细菌的纯培养物，可以保持在不同的培养基上，但一般使用分离时的培养基，或根据分离菌株的特殊要求而另行配制。

将分离后的菌株的纯培养物，穿刺接种于装有其所需的固体培养基的试管内，置于厌氧缸中，在光照的条件下进行培养，待长好后取出，在试管中加入无菌的液体石蜡，以隔断空气，便可保存较长时间。也可以将保存用的菌株试管，放入大型试管中，在其底部加吸氧剂，大试管用塞子塞紧并抽气减压进行培养。在此条件下，大约1年中移植1次，可保存具有强活力的菌株。

（作者：张文革）